遺伝性脊髄性筋萎縮症の分子遺伝学



東京女子医科大学小児科助教授斎藤加代子　　
同　小児科白岩　由美　　



図1　SMA遺伝子の位置
動　向

　脊髄性筋萎縮症(spinal muscular atrophy: SMA)において、その遺伝子は図1のように、1990年にGilliamら1)のコロンビア大学グループから、引き続きMelkiら2)フランスグループから、第5染色体長腕のマーカーと強く連鎖していることが証明された。しかし、この染色体領域の不安定性、すなわち反復配列が多くあることや偽遺伝子の存在によってSMAの責任遺伝子同定は困難となっていた。ところが連鎖不平衡の存在と大きな欠失の証明によって、1993年にはSMA遺伝子は染色体5q13に存在することが推定され3)、各国で遺伝子同定の努力を積み重ねてきた4,5)。1995年のCellの80巻1号に2つの研究室から独立にSMAの候補遺伝子に関する論文が発表された。Melkiら6)フランスのグループからsurvival motor neuron(SMN)遺伝子、またMacKenzieら7)のカナダグループからneuronal apoptosis inhibitory protein(NAIP)遺伝子がSMAの候補遺伝子として発表された。両論文において多数のSMA患者のDNAにおけるSMN遺伝子とNAIP遺伝子の変異(主に欠失)を同定し報告している。引き続き世界各国でもこれらの候補遺伝子についてSMA患者における追試が報告され8-10)、さらに蛋白レベルの研究や臨床的重症度との関係も検討されてきている11)
　これらの2つの候補遺伝子のうち、どちらがSMAの原因遺伝子であるかが論議されている。現在、SMN、NAIPのいずれもSMA原因遺伝子とはいい切れない。これらの遺伝子産物がheterodimerを形成している可能性やmodifier geneの存在の可能性なども推測され、SMAの病因の解明が期待される。


A. SMAの診断基準と分類

　SMAは脊髄の前角細胞の変性による筋萎縮と進行性筋力低下を特徴とする常染色体性劣性遺伝病である。SMAの遺伝子同定のためには明確な診断基準と分類を確立することが必要であるという考えのもとに、International SMA Collaborationが組織され、表1の診断基準12)が作成された。これを満たすものが典型的SMAであり、遺伝子的に単一の疾患単位である。一方、表1のExclusionに当てはまるような所見を示す場合、遺伝子的に異質である可能性が高い。このSMAの異質性に関しては後に述べる。

表1 SMAの診断基準
Inclusion包含基準とExclusion除外基準よりなっている。
Inclusions

1.Weakness
　対称性
　近位筋>遠位筋
　下肢>上肢
　躯幹及び四肢
2.Denervation
　舌のfasciculation、手の振戦
　筋生検-groups of atrophic fibers
　EMG-神経原性変化

Exclusions
  1. CNS機能障害
  2. 関節拘縮症
  3. 外眼筋、横隔膜、心筋の障害、聴覚障害、著しい顔面筋罹患
  4. 知覚障害
  5. 血清CK値>正常上限の10倍
  6. 運動神経伝達速度<正常下限の70%
  7. 知覚神経活動電位の以上
(Meeting Report of International SMA Consortium,199112) による。)


　SMAの分類としては、発症年齢、臨床経過に基づき、1型(重症型、Werdnig-Hoffmann病)、2型(中間型)、3型(軽症型、Kugelberg-Welander病)に分類される。1型は生下時に6ヶ月までの発症で、座位不可能、1歳までに80%、2歳までに100%が死亡する重症型である。2型は1歳6ヶ月までの発症、起立または歩行が不可能、2歳以上に生存する。3型は1歳6月以降に発症、歩行が可能な型である。それぞれの型の中でも、臨床的重症度は多様であり、1型から3型までの分布はなだらかであるため、Dubowitzは1型、2型、3型をそれぞれ、より重症な症例から軽症な症例へ1.1〜1.9、2.1〜2.9、3.1〜3.9と分類し、4.0を正常としている13)。

B. 2つの候補遺伝子−SMN遺伝子とNAIP遺伝子

　SMA遺伝子は染色体5q13に存在することが推定され、MelkiらのグループのLefebvreら6)はこの領域に500kbにわたるinverted duplicationを示し、そこに20kbのSMN遺伝子を同定した(図2上段)。SMN遺伝子は、テロメア側コピーにあり、SMNtまたはSMNSMAと示される。9つのexonを有し、mRNAのサイズは1.7kb、294アミノ酸残基よりなる、セントロメア側コピーのSMNcまたはSMNcopyと5bpの違いがある。
図2　SMAの候補遺伝子の位置
　一方、MacKenzieらのグループのRoyら7)は胎児脳のcDNAライブラリーをスクリーニングして、まずNAIP遺伝子のexon13を同定し、さらに70kbのNAIP遺伝子全体を同定した(図2下段)。mRNAは肝で6および7kb、胎盤で7kbであり、脊髄やリンパ芽球でも認められた。16のexonを有し、1232アミノ酸残基よりなり、exon5-7と9-11はウイルスによって生じる昆虫の細胞のアポトーシスを抑制するbaculovirus apoptosis inhibitory proteinとホモロジーを示しており、神経細胞のアポトーシスの面からSMAの病因との関連が期待される。SMN遺伝子とNAIP遺伝子の特徴の比較を表2に示す。

表2 SMN遺伝子とNAIP遺伝子の特徴と比較
Survival Motor Neuron (SMN)Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP)
アミノ酸残基2941232
遺伝子(kb)2070
エクソン916
mRNA(kb)1.76 and 7
ホモロジー-エクソン5-7と19-11:baculovirus apoptosis inhibitory protein
コピーSMNc: centromeric copyintact NAIP geneは1コピー
SMNt: telomeric copy 5bpの差



C. SMA患者におけるSMN遺伝子、NAIP遺伝子(表3)

表3 SMN遺伝子、NAIP遺伝子の欠失(Lefebvreら6) ,Royら7) による)
Survival Motor Neuron (SMN) 遺伝子Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP) 遺伝子
対照SMNc遺伝子欠失: 4.5%NAIP遺伝子欠失: なし
SMNt遺伝子欠失: なし
SMASMNt exon7,8欠失 213/229 (93%)NAIP遺伝子欠失 exon5,6欠失
SMNt exon7欠失 13/229 (6%)1型 17/38 (45%)
SMNt intron内欠失 2/2292型、3型 13/72 (18%)
SMNt exon6点突然変異 1/229


　MelkiグループのLefebvreら6)はSMA患者のDNAのSSCP分析において、SMN遺伝子は229例中213例(93%)にSMNtのexon7、8のホモ接合性欠失を示し、13例(6%)ではSMNtのexon7のホモ接合性欠失を示したことを報告した。残り3例のうちで2例でintron内の欠失を、1例でexon6内のTAT→TGTのミステンス変異を示した。246例のコントロールではSMNtの少なくても1コピーは変異を示さず、11例(4.5%)でSMNcのホモ接合性欠失を示した。型と欠失頻度との相関はなかった。
　van der Steegeら14)はSMNt遺伝子とSMNc遺伝子のexon7とexon8の領域における塩基配列の5bpの差を利用して、SMA患者のDNAにおいてexon7とexon8をそれぞれ独立にPCR増幅し、産物をそれぞれ制限酵素Dra1とDde1で処理する方法を報告した。我々はこの方法により、SMA46家系48例のうち39家系(83%)、1型14家系中12家系(86%)、2型21家系中21家系(100%)、3型11家系中6家系(55%)にexon7,8の両者またはexon7のみの欠失を認めた15)。SMN遺伝子の欠失の割合は、上記以外にイギリス(140例の98%)、オランダ(103例の93%)、スイス(62例の90%)、ベルギー(23例の91%)、トルコ(69例の91%)などのSMA患者の90%以上であり、台湾の89例でも98.9%である。我々の日本人のSMA患者の46家系中83%は低い値であった。
　NAIP遺伝子はMacKenzieグループのRoyら7)が、110例のSMAにおいて、1型38例中17例(45%)、2および3型72例中13例(18%)にexon5,6の欠失を報告し、型と欠失の頻度との相関を示唆した。我々は1型の2例にてNAIP遺伝子の欠失を認め、この例はSMN遺伝子も欠失していた15)。各国におけるNAIP遺伝子の欠失の割合はオランダ(103例の37%)、スイス(62例の47%)、トルコ(69例で1型の70%、2型の15%)と高く、台湾では89例中21.3%であった。我々日本人の結果は、46家系中1型の2例のみであり、日本人のSMAにおける欠失領域は諸外国に比して小さいと考えられる。
　SMNtとSMNcの関係についていくつかの議論がある。Lefebvreら6)はコントロールとSMA患者の培養リンパ芽球の転写産物をSMNcとSMNtのexon6からexon8のRT-PCRによって調べた。コントロールではSMNcのexon6,7,8の転写産物とSMNcのexon7がalternative splicingを受けたexon6とexon8からなる短い転写産物の2種類を有し、コントロールのSMNtはexon6,7,8の転写産物のみを有していた。またコントロールではSMNcを欠く例を認めた。SMA患者ではSMNtの欠失を示したが、SMNcは正常であった。DiDonatoら16)はSMNt遺伝子のexon7のみが欠失している2型3例と3型2例において、SMNt遺伝子のexon7とexon8を含む領域を増幅し、塩基配列を調べたところ、SMNt遺伝子のexon7がSMNc遺伝子のexon7と同様の配列に変換されていたことを明らかにした。したがって、SMNtのexon7は欠失していたのではなく、遺伝子変換されており、重症な1型ではホモ接合性にSMNt遺伝子のexon7とexon8の欠失を有しているが、軽症の2型、3型ではSMNt遺伝子のexon7がSMNc遺伝子のexon7に変換されることによって、1つのアリルがfunctionalであり、症状が軽症である可能性を示唆している。
　SMNとNAIPの2つの候補遺伝子のうち、どちらがSMAの原因遺伝子であるかが議論されている。表4に原因遺伝子であることを肯定する根拠と否定する根拠をあげた。SMN遺伝子に関しては、先に述べたようにSMA患者の大半においてSMNt遺伝子の変異を認めることはSMAの原因遺伝子である可能性を示唆している。しかし患者の無症状の同胞にSMNt遺伝子の欠失を認める報告があること、SMNc遺伝子が組織で発現しているが症状に影響がないこと、症状の重症度と欠失の頻度に相関がないことなど否定的な意見もある。

表4 SMN遺伝子、NAIP遺伝子がSMAの原因遺伝子であることを肯定する根拠と否定する根拠
Survival Motor Neuron (SMN)Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (NAIP)
肯定根拠-SMAの229例全例にSMN遺伝子の変異-症状の重症度と欠失頻度に相関がある
-昆虫の細胞のアポトーシス抑制遺伝子とホモロジー
否定根拠-SMA患者の無症状の同胞にSMN遺伝子の欠失-SMA患者の無症状の親3例にNAIP遺伝子の欠失
-SMNcは組織で発現しているが症状に影響がない-NAIP遺伝子の欠失はSMA患者全例で認めたのではない
-症状の重症度と欠失の頻度に相関なし
-SMA患者で5q関連マーカーの欠失を認めることがある


　症状と欠失の頻度との相関がないという意見に対して、MelkiらのグループのBurglenら17)は転写因子TFIIHのサブユニットp44の遺伝子がSMA遺伝子領域にp44tとp44cとして重複した状態で存在し、SMAの1型においてp44t遺伝子を含む大きな欠失を示す例が68%であり、臨床症状の重症度はp44t遺伝子が可能性を示唆した。
　一方、SMNの機能については、Liu & Dreyfussら18)がSMNが細胞の核の構造物"gem"に局在する蛋白質であり、RNA結合蛋白と反応するものであること、SMAはRNA代謝の転写後の機能における欠陥によって生じることを示した。Lefebvreら11)はSMN蛋白レベルの研究を行い、SMN蛋白の発現の障害によってSMAが生じること、そしてSMNc遺伝子によってコードされる蛋白の量とSMAの臨床像の間の強い関連(1型では3型より著明に減少)をSMA患者52例において観察した。さらに、形態学的、免疫化学的実験によってSMAの標的細胞である運動ニューロンにおける強いSMN蛋白の発現の証拠を示した。またSMA1型と3型の運動ニューロンにおいて、核のSMNc染色のそれぞれの欠損と著明な減少を証明した。

Ｄ．SMAの異質性

　International SMA Collaborationによって表1に示すように、SMAの診断基準が作成されたことは先に述べた。この診断基準に基づいて診断した場合、SMAに似ているが、SMAとは異なった病因の疾患が存在するbrRudnik-Schonebornら19)は200例以上の患者のうち、少なくとも1つ以上の除外基準を示す例について臨床像の特徴とSMN遺伝子の欠失を調べた。その結果、遺伝子5qのマーカーに連鎖しておらず、またSMN遺伝子の欠失も示さないSMA plus variantというカテゴリーに入る7例について述べ、これらをSMA+横隔膜麻痺、SMA+オリーブ橋小脳低形成、SMA+先天性関節拘縮と診断し、これらの遺伝子は染色体5q13にないと述べている。また、常染色体性優性遺伝形式のSMAが報告されているが、この遺伝子も第5染色体20)には局在しない。

Ｅ．DNAマーカーを用いたハプロタイプ解析による遺伝子診断、出生前診断

　SMAの遺伝子領域において多くのマイクロサテライトDNAマーカーが報告され21-26)、SMAの家系における遺伝子診断に応用されている。特に、出生前診断では高い精度が要求される。そのため、SMN遺伝子、NAIP遺伝子の欠失を調べるとともに、SMA遺伝子領域のDNAマーカーを用いたハプロタイプ解析が有用である。欧米ではSMA、特に重症の1型と2型については出生前診断の適応とされ、施行されてきている。最も多くの症例の報告としては、Wirthら27)の論文がある。彼らは出生前診断を希望した家系137例において、28例でSMAの診断が不確定なため除外し、残る109例において出生前診断を施行した。73例で非罹患者、29例で罹患者、7例で組換えのため遺伝子型がSMA/SMAであるかSMA/正常であるか不確かであった。73例の非罹患者のうち、32例において健康児の出生を確認でき、41例では出生後の回答がなかった。罹患者と診断された29例と組換えのあった7例、計36例では両親は中絶を決意していた。


むすび

　脊髄の前角細胞の変性による筋萎縮と進行性筋力低下を特徴とする常染色体性劣性遺伝病であるSMAの原因候補遺伝子であるSMN遺伝子とNAIP遺伝子に関して、最近の知見を述べた。
　諸外国ではSMN遺伝子ホモ結合性欠失はSMA患者の90%以上で認めている。我々は日本人患者46家系の83%に欠失を認めた。NAIP遺伝子は重症度と欠失の割合は相関し、諸外国では1型の40〜70%であり、我々日本人46家系の結果は1型14家系のうち2例のみで欠失を示しており、日本人のSMAにおける欠失領域は諸外国に比して小さいと考えられた。
　SMNは細胞の核の構造物"gem"に局在する蛋白質であり、RNA結合蛋白と反応するものであること、SMAはRNA代謝の転写後の機能における欠陥によって生じることが明らかになってきている。また、SMN蛋白レベルの研究では、SMN蛋白の発現の障害によってSMAが生じること、そしてSMNc遺伝子によってコードされる蛋白の量とSMAの臨床像の間に強い関連があることが観察されている。
　一方、NAIPのexon5-7と9-11はウイルスによって生じる昆虫の細胞のアポトーシスを抑制する遺伝子とホモロジーを示しており、神経細胞のアポトーシスの面からSMAの病因との関連が興味深い。
　これらの候補遺伝子が病因に大きく影響しているのは確かであるが、SMAの原因はいまだすべては解明されていない。脊髄の細胞レベルにおける遺伝子の発現、その機能などが明らかにされることは、本症の治療法の開発へ発展する可能性が考えられ、期待される。
文献

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